Mieux comprendre les échecs de traitement du virus de l’hépatite B grâce aux tests phénotypiques

par : Julien Marlet

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comment ça marche ?

À propos de ce projet

Le traitement de l’hépatite B chronique repose sur l’utilisation d’antiviraux au long cours. Ce traitement long est à risque d’échec thérapeutique car le virus peut devenir résistant aux antiviraux utilisés. Cette résistance est conférée par une ou plusieurs mutations de résistance (adaptation du virus aux antiviraux) et peut toucher un ou plusieurs antiviraux. Pour savoir lesquels, on réalise un examen relativement simple appelé « séquençage du virus de l’hépatite B ». Mais pour certains patients en situation d’échec thérapeutique, cet examen n’est pas contributif car aucune mutation de résistance connue n’est détectée malgré une forte suspicion de résistance.

Nous émettons l’hypothèse que pour ces patients en échec thérapeutique inexpliqué, il existe une résistance du virus conférée par une mutation encore inconnue. Nous proposons de poursuivre les investigations par un test plus complexe, appelé « test phénotypique de résistance ». Cela consiste à recréer l’infection au laboratoire à partir d’une partie du génome du virus du patient et à observer si le virus est capable de se multiplier en présence ou non de l’antiviral.

Notre objectif est de montrer que ce nouveau test, associé au « séquençage », permet de détecter un plus grand nombre de résistances virales et d’adapter le traitement de l’hépatite B en conséquence.

Contexte

Au laboratoire de Virologie du CHU de Tours, nous suivons les patients vivants en région Centre-Val de Loire, infectés par le VHB et traités par des antiviraux. Au cours de ce suivi, nous détectons régulièrement un échec thérapeutique (absence de contrôle de l’infection), ce qui nous alerte sur le risque de résistance du virus au traitement et sur l’importance d’une prise régulière des antiviraux par le patient. La résistance est explorée par « séquençage » du génome viral et la prise des antiviraux est explorée par dosage sanguin des antiviraux.

Théoriquement, ces approches permettent de trouver la cause de l’échec thérapeutique. Pourtant, pour une vingtaine des patients que nous suivons, ces tests n’ont retrouvés aucune explication à l’échec thérapeutique. En l’absence de mécanisme identifié, le traitement est soit poursuivi tel quel ou modifié par ajout d’un autre antiviral, mais cela n’est pas toujours possible et les résultats sont inconstants.

Pour répondre à ces demandes précises des médecins et pour comprendre de manière plus générale les mécanismes des échecs thérapeutiques inexpliqués, nous avons décidé de poursuivre les investigations par un test plus complexe, appelé « test phénotypique de résistance », décrit précédemment. Des travaux préliminaires avec ce test phénotypique nous ont déjà permis d’expliquer certains échecs thérapeutiques inexpliqués. Nous avons mis en évidence des résistances du virus aux antiviraux qui n’avaient pas pu être détectés par simple « séquençage ».

Ces résultats encourageant nous incitent à poursuivre dans cette voie et à améliorer ces tests phénotypiques. La principale optimisation envisagée est de copier la totalité du génome du virus avant de réaliser le test phénotypique. Nous espérons ainsi détecter un plus grand nombre de virus résistants.

Objectif

L’objectif de notre projet est de mettre au point des « tests phénotypiques de résistance » permettant d’améliorer la détection des virus résistants au traitement de l'hépatite B. Associé au « séquençage du virus », ils devraient permettre de choisir l’antiviral le plus adapté chez chaque patient en échec thérapeutique pour l’obtention d’une bonne réponse au traitement.

Notre projet contribuera ainsi à prévenir les complications graves de l’hépatite B chronique telles que la cirrhose et le cancer du foie.

Etapes

1) Extraction du génome viral entier pour chaque patient

Nous travaillons à partir de prélèvements sanguins déjà réalisés dans le cadre du suivi des patients. Dès l’obtention d’un avis éthique favorable (demande en cours), nous pourrons étudier ces prélèvements. La première étape de notre travail consiste à extraire et à purifier le génome viral contenu dans ces prélèvements sanguins, en éliminant toute substance qui pourrait interférer avec les étapes suivantes.


2) Copie du génome viral entier infectant chaque patient par une technique de « PCR »

Le génome viral extrait et purifié est présent en trop petite quantité pour être directement étudié au laboratoire. Il est nécessaire d’en réaliser au préalable de nombreuses copies par une technique de polymérisation en chaine (PCR), sorte de photocopieuse à génome.


3) Étude de chaque virus au laboratoire dans un « simulateur d’infection »

Une fois notre génome viral copié en de nombreux exemplaires, nous l’introduisons dans une culture de cellules de foie pour simuler au laboratoire l’infection du foie du patient. Le virus est cultivé pendant 7 jours en présence d’un antiviral à tester. Ces expériences sont réalisées en en laboratoire de confinement microbiologique de niveau 3 car elles nécessitent la manipulation de virus de l’hépatite B infectieux.


4) Extraction et détection

A l’issu des 7 jours de culture, les cellules de foie infectées sont récupérées et le génome viral qui s’y est répliqué est extrait et purifié. Il est ensuite quantifié par technique de PCR (cf. ci-dessus). Si le virus s’est répliqué en présence de l’antiviral, la résistance est prouvée. Des tests complémentaires permettent ensuite d’identifier la ou les mutations de résistances impliquées et l’antiviral restant actif sur ce virus.

Budget : 7 500 €

Libellé
Montant
Extraction du génome viral
500 €
Copie des génomes viraux par PCR
2 000 €
Simulation de l'infection au laboratoire par culture
3 000 €
Extraction et détection des virus
2 000 €

1) L'extraction du génome viral nécessite l'utilisation d'un système semi-automatisé (EZ1 de chez Qiagen) déjà disponible au CHU de Tours. Pour l'utiliser, il nous faut acheter des réactifs sous forme de barrettes unitaires permettant d'extraire rapidement et efficacement les génomes viraux de chacun des échantillons de patients. L'enjeu de cet étape est de récupérer un maximum de génome viral à partir d'échantillons qui parfois en contiennent peu.

2) L'étape de copie des génomes viraux nécessite l'utilisation d'une enzyme polymérase. Nous avons choisi l’enzyme polymérase Q5 (NEB) qui permet de réaliser de nombreuses copies du génome viral sans introduire d’erreurs entre chaque copie. Cette enzyme est disponible en très petites quantités, d’où un coût élevé, l’un des plus importants de notre projet.

3) La simulation de l’infection nécessite l’utilisation de lignées cellulaires dérivées de carcinomes hépatiques humains. Ces lignées sont déjà disponibles au laboratoire mais leur utilisation nécessite l’achat de milieux de culture particuliers (DMEM) riches en sucres et en acides aminés (glutamine). Pour mimer l’infection dans ces cellules, il est nécessaire d’introduire le génome viral en franchissant la barrière membranaire cellulaire. Pour franchir cette barrière, nous utilisons un réactif là aussi assez couteux, dérivé de lipides, appelé Lipofectamine.

4) Enfin, l’extraction des génomes viraux produits au cours de l’infection de ces cellules nécessite un traitement par une enzyme DNase, sorte de ciseaux à génomes, qui vient éliminer tous les génomes contaminants non viraux contenus dans les cellules. Ce réactif est le troisième plus couteux, après l’enzyme polymérase Q5 (2) et la lipofectamine (3).

Approuvé par

Institut national de la santé et de la recherche médicale

Ce projet a été sélectionné par l'Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale dans le cadre du Programme Poste d'Accueil 2016.

Ce programme vise à attirer des jeunes médecins ou vétérinaires vers le milieu de la recherche. Il est destiné à des internes, chefs de clinique assistants ou assistants hospitalo-universitaires, médecins, pharmaciens ou odontologistes, des vétérinaires, titulaires d'un master II recherche et de la thèse d’exercice à la date de prise de fonction. Ce poste permet au lauréat de réaliser un doctorat ès sciences.